Defesa de Tese de Doutorado — Pedro Rafael Firmino Dias

Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas

Pedro Rafael Firmino Dias

Regulação da afinidade por interatores e localização celular da NEK6 pela serina 37 presente no N-terminal desordenado

Auditório da FCF

Presidente
Prof. Dr. Jorg Kobarg — FCF / Unicamp

Membros titulares
Profª Drª Alessandra Sussulini — IQ / Unicamp
Profª Drª Wanda Pereira Almeida — FCF / Unicamp
Profª Drª Deborah Schechtman — IQ / USP
Profª Drª Nadja Cristhina de Souza Pinto – Instituto de Química — IQ / USP

Membros suplentes
Prof. Dr. Paulo Guimarães Gandra — IB / Unicamp
Prof. Dr. Marcelo Lancellotti — FCF / Unicamp
Drª Talita Diniz Melo Hanchuk — LNBio / CNPEM
Prof. Dr. Danilo Bilches Medinas — IQ / USP

Resumo
As NEKs são uma família de serina/treonina e tirosina quinases altamente conservadas com funções relacionadas na integração do ciclo celular com sinalização de proliferação, resposta ao dano de DNA, metabolismo do cílio primário, progressão da mitose, além de funções relacionadas à inflamação, homeostase mitocondrial e redox. O eixo mitótico das NEKs está relacionado com as funções das NEK6, NEK7 e NEK9. A NEK6 é um dos menores membros das NEKs, sua ativação e regulação na progressão da mitose não estão completamente elucidados. A atividade quinase da NEK6 é regulada após estresse genotóxico através da fosforilação pela CHK1 e CHK2, no entanto o resíduo fosforilado não foi identificado, apenas foi observado que o resíduo fosforilado está localizado no N-terminal da NEK6 (aminoácido 1-80). Inicialmente hipotetizamos que o resíduo fosforilado da NEK6 pela CHK1 e CHK2 é a serina 37, por este ser o único resíduo dentro do N-terminal identificado como fosfopeptídeo experimentalmente. No entanto, não foram identificadas alterações na atividade quinase da NEK6 em mutantes fosfomiméticas e fosfodeficiêntes da serina 37. Dessa forma, hipotetizamos que a serina 37 pode regular a afinidade da NEK6 com alguns interatores sem alterar sua atividade quinase. Realizamos uma análise de sítios funcionais e regulatórios da NEK6 utilizando ferramentas in silico, e obtivemos um modelo da estrutura de alta resolução da NEK6 utilizando o software AlphaFold2. Foi possível observar através da análise dos modelos estruturais da NEK6 que a serina 37 não está na interface de homodimerização, corroborando a ideia de que a fosforilação da serina 37 não afeta a homodimerização e autoativação da NEK6, e consequentemente sua atividade quinase. Posteriormente, analisamos se a serina 37 possui relação com a regulação da homodimerização, autoativação, localização celular e estabilidade da NEK6. Utilizamos vetores de expressão em células de mamíferos clonados com a sequência selvagem da NEK6 de Homo sapiens (313 aminoácidos), com mutações fosfomiméticas e fosfodeficiêntes na serina 37 fusionadas com FLAG (pcDNA3.1) e GFP (pGFP). As construções fusionadas ao FLAG e GFP foram cotransfectadas em células HEK293T por 30 horas. Utilizamos a fluorescência do GFP para analisar a localização celular da NEK6 através do microscópio de fluorescência, e realizamos a imunoprecipitação das construções fusionadas ao FLAG utilizando beads de agarose conjugadas com IgG anti-FLAG. Analisamos a homodimerização pela coprecipitação da GFP-NEK6 com o imunoprecipitado de FLAG-NEK6 e a auto-ativação e estabilidade por western blot. Nossos dados indicam que a NEK6 possui capacidade de homodimerização e auto-ativação, nos quais não são afetadas pela serina 37. A estabilidade da NEK6 também não foi afetada pela serina 37. Identificamos que a serina 37 e a interação com a NEK9 regulam a localização celular da NEK6, e a serina 37 está relacionada com a regulação da afinidade da NEK6 com a beta tubulina e a gama tubulina. Em dados não apresentados, identificamos que a NEK6 fosfomimética da serina 37 transfectadas em células HEK293T e desafiadas com a remoção do FBS foram capazes de sobreviver por 4 meses sem alteração do meio de cultivo celular, indicando que a fosforilação da serina 37 está relacionada ao menos com vias de sobrevivência e senescência. Em uma análise filogenética nós identificamos que a Nek6 surgiu em vertebrados após uma duplicação gênica, e a serina 37 surgiu nos mamíferos. Dessa forma, nossos dados indicam que a serina 37 da NEK6 regula sua localização celular e afinidade a interatores sem modificar sua atividade quinase, provavelmente sendo o resíduo fosforilado pela CHK1 e CHK2 após estresse genotóxico, no qual pôde ter conferido alguma vantagem evolutiva aos mamíferos. Identificamos também que a serina 37 regula um fenótipo que aparentemente são centrossomos amplificados, no qual necessita de confirmação através da análise da colocalização da NEK6 com proteínas centrossomais através de imunofluorescência em microscópio de fluorescência.