Defesa de Tese de Doutorado — Isadora Carolina Betim Pavan

Isadora Carolina Betim Pavan

Estudo funcional e molecular da quinase humana NEK6 como alvo de drogas contra câncer de próstata

Local: Auditório da FCF | transmissão ao vivo

Presidente
Prof. Dr. Jörg Kobarg

Membros titulares
Profª Drª Ana Lucia Tasca Gois Ruiz — FCF / Unicamp
Profª Drª Clarissa Ribeiro Reily Rocha — EPM / Unifesp (videoconferência)
Dr. Marcos Rodrigo Alborghetti — LNBio / CNPEM
Profª Drª Natassia Elena Bufalo — SLMandic (videoconferência)

Membros suplentes
Drª Daniela Campos Granato — LNBio / CNPEM
Profª Drª Mirian Galliote Morale — ICAQF / Unifesp (videoconferência)
Prof. Dr. Armando Morais Ventura — ICB / USP (videoconferência)

Resumo: Introdução: NIMA (Never In Mitosis, gene A)-related kinase-6 (NEK6) pertence a uma superfamília de proteínas composta por 11 membros de quinases relacionadas a NIMA. As funções da NEK6 são pouco estudadas, exceto por sua participação já evidenciada no ciclo celular. A literatura tem mostrado sua relevância no câncer de próstata resistente à castração (CPRC), evidenciando seu papel central no crescimento do tumor independente de andrógeno, sugerindo que NEK6 regula vias de sobrevivência celular. No entanto, ainda não está claro quais são essas vias e mecanismos regulados por NEK6 que a fazem participar do CPRC. Objetivo: O objetivo desse estudo foi explorar a NEK6 no CPRC, avaliando os efeitos celulares na ausência da sua expressão e inibição, bem como identificar os mecanismos moleculares de sobrevivência que NEK6 regula nesse câncer. Além disso, também avaliamos a relevância da depleção e/ou inibição de NEK6 no contexto do tratamento de quimioterápicos utilizados no CPRC, tais como cisplatina e docetaxel. Material e métodos: Foram geradas células nocautes de NEK6 nas linhagens celulares DU-145 e PC-3 utilizando o sistema CRISPR/Cas9. O uso de um inibidor específico de NEK6 também foi testado nas células DU-145 e PC-3. Ensaios funcionais para avaliar viabilidade, capacidade clonogênica, morte celular, migração, geração de Espécies Reativas de Oxigênio (ROS), permeabilidade da membrana mitocondrial foram realizados nessas células. Avaliação da expressão a nível de RNA mensageiro e proteico de genes relacionados à progressão e quimioresistência no câncer de próstata foram realizados. Resultados: Os nocautes de NEK6 diminuiram a capacidade clonogênica, proliferação, viabilidade celular e a atividade mitocondrial. A depleção de NEK6 aumentou o nível de ROS intracelular; diminuiu a expressão das defesas antioxidantes (SOD1, SOD2 e PRDX3); aumentou a fosforilação de JNK, uma quinase responsiva ao estresse; e aumentou os marcadores de dano ao DNA (p-ATM e γH2AX). A superexpressão exógena de NEK6 também aumentou a expressão dessas mesmas defesas antioxidantes e diminui γH2AX. A depleção de NEK6 induziu a morte celular por apoptose e reduz a proteína anti-apoptótica Bcl-2. As células com falta de NEK6 têm mais sensibilidade à cisplatina. NEK6 regulou a localização nuclear de NF-κB2, sugerindo que NEK6 pode regular a atividade de NF-κB2. Portanto, NEK6 altera o equilíbrio redox, regula a expressão de proteínas antioxidantes e danos ao DNA, e sua ausência induz a morte de células DU-145. Observamos que a inibição de NEK6 sensibilizou as células DU-145 ao tratamento com docetaxel, induziu marcadores significativos de apoptose (clivagem de PARP1, BAK), reduziu as vias de sobrevivência (p65 fosforilado) e migração celular (TJP1). O inibidor de NEK6, individualmente, foi capaz de reduzir significativamente as expressões de Bcl-xL, Bad fosforilado e TJP1. O inibidor de NEK6 exibiu um IC50 atraente em DU-145 e PC-3, podendo ser um composto interessante a ser explorado no câncer de próstata. O co-tratamento com docetaxel e inibidor de NEK6 reduziu significativamente a formação de colônias e a migração celular. O nocaute de NEK6 em células DU-145 e PC-3 sensibiliza as células ao tratamento com docetaxel. Conclusão: NEK6 pode ser um alvo estratégico no câncer de próstata.