Defesa de Dissertação de Mestrado — Bárbara Carvalho dos Reis
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
Bárbara Carvalho dos Reis
Prolil-tRNA sintetases de bactérias Gram-negativas: estudos funcionais e busca por novos inibidores de microrganismos multirresistentes
Auditório da FCF
Presidente
Dr. Gustavo Fernando Mercaldi — LNBio / CNPEM
Membros titulares
Profª Drª Karina Cogo Müller — FCF / Unicamp
Profª Drª Cristina Elisa Alvarez Martinez — IB / Unicamp
Membros suplentes
Drª Priscila Zonzini Ramos — CQMED / Unicamp
Dr. Daniel Maragno Trindade — LNBio / CNPEM
Dr. Ivan Rosa e Silva — LNBio / CNPEM
Resumo
Infecções causadas por patógenos com resistência múltipla a antimicrobianos (RMA) representam uma grave ameaça à saúde pública global, conforme alertado pela Organização Mundial de Saúde (OMS). A Klebsiella pneumoniae, uma bactéria Gram-negativa, é comumente associada a infecções hospitalares e comunitárias em pacientes imunocomprometidos, sendo frequentemente resistente a múltiplos antibióticos. Esse perfil de resistência aumenta significativamente a mortalidade das infecções causadas por K. pneumoniae, colocando-a na lista de patógenos prioritários da OMS, ao lado de outras bactérias Gram negativas. O presente projeto visa estudar a enzima prolil-tRNA sintetase de K. pneumoniae (KpProRS) e explorá-la como alvo molecular para desenvolvimento de novos agentes antimicrobianos efetivos contra bactérias Gram-negativas. A ProRS é responsável pela adição de L-prolina aos RNA transportadores cognatos (GGCtRNAPro), sendo essencial para síntese de proteínas. Assim como outras aminoacil tRNA-sintetases, ela possui capacidade revisora pré e pós transferência do aminoácido para o RNA transportador. Devido a divergências evolutivas entre as ProRS de hospedeiros e patógenos, inibidores seletivos de ProRS têm sido descritos para diversos organismos infecciosos. Explorando a atividade revisora pré-transferência da KpProRS, os parâmetros cinéticos para L-Alanina (KM = 29,91 ± 2,67 mM; Vmax = 0,87 ± 0,04 µM/min) e ATP (K’ = 1,09 ± 0,05 mM; Vmax = 0,45 ± 0,01 µM/min) foram obtidos. A seguir, um conjunto de 5 derivados de febrifugina foram testados contra a KpProRS e se mostraram potentes inibidores da enzima (IC50 de 0,243 até 40 µM). Utilizando RMN-STD, foram mapeados os epítopos mais relevantes para a interação desses derivados com a enzima. Os compostos também foram avaliados contra um painel de bactérias, incluindo Xanthomonas citri, Escherichia coli e K. pneumoniae, com valores de concentração inibitória mínima (MIC) variando de 1 a 32 µg/mL. Estudos de citotoxicidade em células HepG2 mostraram que as moléculas halofuginona, ProRSi-3 e deoxi-halofuginona não causaram reduções significativas na viabilidade celular em concentrações inferiores a 8 µM. Além dos estudos com os derivados de febrifugina, no desenvolvimento deste trabalho também foi realizada uma campanha de triagem automatizada em larga escala (HTS) contra uma biblioteca com 20 mil pequenas moléculas orgânicas de alta diversidade química. Todas as placas de ensaio apresentaram valores de fator Z’ iguais ou superiores a 0,6, indicando a qualidade do experimento. Após ensaios confirmatórios, 6 hits foram confirmados usando ensaios dose-resposta. Os valores de IC50 observados para os novos hits da KpProRS estavam na faixa de 7,48 a 63,91 µM. Em paralelo, foram feitos esforços para cristalizar a KpProRS, que levaram a obtenção cristais da proteína. Esses cristais foram submetidos a experimentos de difração de raios X que geraram conjuntos de dados que tinha uma alta anisotropia, o que impossibilitou a obtenção de um modelo experimental. Os resultados deste estudo forneceram avanços no entendimento KpProRS e suas interações com potenciais inibidores. A continuidade deste estudo, com o refinamento de compostos identificados, expansão de série para os hits e ensaios de caracterização dos mesmos, pode levar ao desenvolvimento de novos agentes terapêuticos eficazes contra bactérias Gram-negativas.