Defesa de Tese de Doutorado — Renan Yuji Miyamoto

Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas

Renan Yuji Miyamoto

Investigação molecular de novas xilose isomerases para aplicação de materiais lignocelulósicos

Sala IB-11, Bloco O, Instituto de Biologia, Prédio da Pós-Graduação (Rua Bertrand Russell esq. Rua Charles Darwin)

Presidente
Drª Letícia Maria Zanphorlin Murakami — LNBR / CNPEM

Membros titulares
Profª Drª Thais Suzane Milessi Esteves — CCET / UFSCar
Dr. Clelton Aparecido dos Santos — LNBR / CNPEM
Prof. Dr. André Ricardo de Lima Damasio — IB / Unicamp
Prof. Dr. Richard John Ward — FFCLRP / USP

Membros suplentes
Prof. Dr. Fernando Segato — EEL / USP
Dr. Célio Cabral Oliveira — LNBR / CNPEM
Profª Drª Rosana Goldbeck Coelho — FEA / Unicamp

Resumo
Xilose é o açúcar mais abundante do planeta depois da glicose. A utilização eficiente deste açúcar se torna um pré-requisito crucial visando a consolidação de uma biorrefinaria. Entretanto, há desafios significativos no que se refere à metabolização eficiente de xilose por microrganismos industriais. A natureza possui três formas de metabolização de xilose, sendo que a via de isomerização por meio de enzimas conhecidas como Xilose Isomerase (XI), tem se apresentado como a mais promissora. No entanto, alguns gargalos como a baixa atividade desta enzima quando produzida em Saccharomyces cerevisiae, um dos microrganismos mais robustos para utilização em bioprocessos, contribui para o baixo aproveitamento da xilose. Diante dessa problemática, o objetivo primário dessa tese de doutorado foi contribuir para disponibilizar tecnologias promissoras para o aproveitamento da xilose na obtenção de commodities, como o etanol, e também para a produção de químicos de valor agregado, como a vitamina B6. Ambas as tecnologias estudadas são dependentes da reação de isomerização catalisada pela XI. Com isso, essa tese está dividida em quatro capítulos. No capítulo 1, apresenta-se o estado da arte sobre XIs, bem como os processos aplicados utilizando-se essas enzimas visando a valorização da xilose. No capítulo 2, mostramos a prospecção de duas XIs (XylA1F1 e XylA2F1) de uma bactéria isolada de solo brasileiro. Diferenças nos parâmetros cinéticos foram observados provavelmente devido à aspectos estruturais de reconhecimento e acomodação da xilose já que a arquitetura de seus sítios catalíticos possui alterações significativas. Apesar dos avanços no conhecimento de propriedades bioquímicas e moleculares obtidos para XylA1F1 e XylA2F1, essas enzimas apresentaram baixa atividade em condições brandas de temperatura para serem utilizadas em um processo de fermentação de xilose, uma vez que a levedura Saccharomyces atua em temperatura próxima de 32 °C. Nesse sentido, no capítulo 3, utilizamos uma abordagem metagenômica combinada com redes de similaridade de sequências para explorar a biodiversidade do solo de manguezais e da Antártica objetivando a descoberta de enzimas capazes de atuar em condições de baixa temperatura. Assim, novos alvos enzimáticos foram caracterizados e comparados com a XI modelo da literatura. Como destaque, vimos que uma das enzimas selecionadas da Antártica (ArXI) apresentou melhor performance nas condições de fermentação. Entretanto, quando a S. cerevisiae foi transformada com as XIs, a XI modelo apresentou melhor taxa de crescimento em xilose, apesar da enzima ArXI ter melhor performance nos ensaios in vitro. Esse resultado sugere que a metabolização de xilose por microrganismo engenheirado com XI não depende exclusivamente dos aspectos funcionais enzimáticos, revelando uma complexidade notória na sinergia de produção e enovelamento proteico, performance enzimática e taxa de consumo de xilulose dentro do microrganismo. Diante desses resultados, no capítulo 4 avaliamos uma nova abordagem para valorização da xilose, de forma alternativa à engenharia metabólica. Para este fim, desenvolvemos uma rota sintética baseada no uso de uma cascata enzimática capaz de converter xilose em vitamina B6. Análises in sílico demonstraram a termodinâmica favorável para essa rota sintética, e modelagens computacionais indicaram uma condição inicial para produzir vitamina B6. A prova de conceito experimental foi realizada com xilose sintética e a viabilidade corroborada. Após experimentos de otimização, nos quais modificamos a concentração enzimática e de cofatores, a produção de vitamina B6 foi aumentada em 42 %. De modo a validar a tecnologia desenvolvida em um ambiente industrialmente relevante, utilizamos hidrolisado lignocelulósico como fonte de xilose. Os resultados confirmaram a eficiência da cascata em transformar xilose em vitamina B6, demonstrando a robustez da nossa tecnologia. Assim, realizamos uma análise de Plackett-Burman para identificar as variáveis significativas para esse processo, possibilitando o aumento da produção de vitamina B6 em 117 % a partir do hidrolisado do bagaço de cana de açúcar. Portanto, esse trabalho de doutorado além de aprofundar no entendimento molecular que dirige a atividade enzimática de XI, também traz perspectivas inovativas para a valorização de resíduos agroindustriais, em especial, a xilose, para produção de bioprodutos, contribuindo, portanto, para uma economia circular sustentável.