Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
Jean Rodrigo Santos
Identificação e caracterização de moduladores da enzima UBE2A por triagem automatizada de alto rendimento
Auditório MD02
Presidente
Dr. Ivan Rosa e Silva — LNBio / CNPEM
Membros titulares
Prof. Dr. Rafael Victorio Carvalho Guido — IFSC / USP
Prof. Dr. Marcio Vinicius Bertacine Dias — ICB / USP
Dra. Luíza dos Reis Cruz — DNDi América Latina
Membros suplentes
Prof. Dr. Daniel Gedder Silva — FCF / USP
Prof. Dr. Luís Fernando Saraiva Macedo Timmers — Univates
Resumo: A ubiquitinação de proteínas regula processos celulares essenciais, incluindo a renovação proteica, a transdução de sinais e a regulação do ciclo celular. A enzima E2 UBE2A constitui um alvo de grande relevância em virtude de seu papel no neurodesenvolvimento, de sua associação à deficiência intelectual ligada ao cromossomo X e de sua superexpressão em tumores. Neste estudo, foi estabelecida uma plataforma de triagem de alto rendimento (do inglês high-throughput screening, HTS) para a identificação de pequenas moléculas moduladoras da UBE2A. As proteínas humanas UBE2A, ubiquitina, UBA1 e ubiquitina marcada com fluoróforo foram expressas, purificadas e empregadas em um ensaio de polarização de fluorescência otimizado para HTS. A triagem da biblioteca ChemBridge CNS (20.000 compostos) apresentou valores robustos de fator Z′ (> 0,5). A análise estatística permitiu identificar 16 potenciais ativadores e 124 inibidores priorizados. Destes compostos, 57 inibidores apresentaram inibição ≥80%. Ensaios de dose-resposta e contra-triagens confirmaram 10 inibidores com valores de IC₅₀ entre 7 e 20 µM e elevada seletividade em relação à UBA1 (índice de seletividade ≥ 5). Apenas um composto apresentou potencial atividade ativadora fraca e não reprodutível. A análise de relação estrutura-atividade dos hits inibidores (do inglês, structure–activity relationship, SAR), abrangendo quatro quimiotipos, destacou características associadas à atividade inibitória, incluindo arcabouços semirrígidos e substituintes heteroaromáticos (por exemplo, piridona, piperazina e imidazol), sendo a atividade dependente de um equilíbrio adequado entre polaridade, lipofilicidade e capacidade de formação de ligações de hidrogênio. A validação biofísica e estrutural incluiu fluorimetria diferencial de varredura (do ingês differential scanning fluorimetry, DSF), na qual dois compostos induziram deslocamentos térmicos negativos (ΔTm de até –3,0 °C), sugerindo ligação direta à proteína. A UBE2A foi cristalizada em duas condições distintas, resultando em estruturas de alta resolução (1,51 Å) nas formas dimérica e monomérica. Experimentos de soaking realizados com mais de 400 cristais revelaram um composto quimicamente transformado nas proximidades da cisteína catalítica Cys88. Em conjunto, este trabalho fornece uma base para futuros estudos mecanísticos, para a otimização orientada por estrutura e para o desenvolvimento de sondas químicas destinadas à investigação da função da UBE2A no neurodesenvolvimento e no câncer.