Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
Kauany de Oliveira Ferreira
Nek8, uma serina/treonina quinase reguladora do ciclo celular: estudo funcional de mutações encontradas em câncer de cólon humano
Auditório MD02
Presidente
Prof. Dr. Jörg Kobarg — FCF / Unicamp
Membros titulares
Profª Drª Leticia Fröhlich Archangelo — FMRP / USP
Profª Drª Ana Paula Ulian de Araújo — IFSC / USP
Membros suplentes
Prof. Dr. Marcelo Lancellotti — FCF / Unicamp
Resumo: A NIMA-related kinase 8 (NEK8) é uma serina/treonina quinase envolvida em processos celulares essenciais, incluindo ciliogênese, manutenção da estabilidade genômica, resposta ao dano no DNA. Embora alterações na expressão da NEK8 tenham sido associadas a diferentes tipos de câncer, seu papel no câncer colorretal permanece pouco compreendido. Neste trabalho, objetivou-se caracterizar funcionalmente a NEK8 em modelo de câncer colorretal, investigando mutações encontradas em pacientes de acordo com o banco de dados COSMIC, sua participação na resposta ao dano ao DNA e seu interatoma em condições basais e de estresse genotóxico. Inicialmente, foi realizada a subclonagem da sequência codificante de NEK8 nos vetores pEGFP-C2 e FLAG-TurboID, seguida da geração das mutantes G149S e V668M por mutagênese sítio-dirigida, selecionadas a partir de análises in silico utilizando bancos de dados e ferramentas preditivas de patogenicidade. As construções foram confirmadas por sequenciamento de Sanger e expressas em células HCT116. Ensaios de imunofluorescência demonstraram localização predominantemente citoplasmática e perinuclear da NEK8. A resposta ao dano no DNA foi avaliada após tratamento com etoposídeo por meio da análise dos marcadores p-CHK1 (Ser345) e γH2AX por Western blot. Observou-se que a superexpressão da NEK8 wild type não alterou significativamente a ativação de CHK1, em concordância com estudos prévios, enquanto a mutante V668M promoveu redução significativa dos níveis de p-CHK1. Além disso, tanto a NEK8 wild type quanto a mutante V668M reduziram significativamente os níveis de γH2AX induzidos por etoposídeo, sugerindo um possível papel na modulação da resposta ao dano genotóxico. Para investigar proteínas associadas à NEK8, foi empregada a estratégia de BioID utilizando TurboID em células HEK293T-REX, seguida de identificação por espectrometria de massas e análises bioinformáticas. O interatoma revelou proteínas relacionadas à dinâmica de microtúbulos, citoesqueleto, ciclo celular, resposta ao estresse, dobramento proteico e resposta ao dano no DNA, indicando que a NEK8 pode atuar como um ponto de integração entre a maquinaria de estabilidade proteica e mecanismos de manutenção da integridade genômica. Em conjunto, os resultados expandem o conhecimento acerca das funções da NEK8 no câncer colorretal, demonstrando que alterações estruturais na proteína podem modificar aspectos da resposta ao dano no DNA e revelando novos potenciais parceiros moleculares que poderão ser explorados em estudos futuros.